单细胞技术中的固定步骤有多重要

M20 Genomics发布的新一代单细胞技术M20 Seq及其产品VITA单细胞全长转录组平台（点击查看），突破了传统单细胞技术的限制，在细胞（核）内通过随机引物进行原位逆转录后，再进行细胞标记，从而实现了包括冻存样本和FFPE样本在内的全样本类型、包括真核生物和原生生物的全物种检测。

为了实现样本的原位逆转录，M20 Seq需要对样本进行有效固定。在组织学、病理学和细胞生物学领域，固定是指保护生物组织不因自溶而腐烂分解。它终止了任何正在进行的生化反应，保存细胞内固有的物质，使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止内源性及外源性酶的反应，使细胞或组织基本上保持与活性状态时的物质一致。对于某些具有传染性的标本，可灭活标本里的致病微生物，能防止疾病的扩散。

甲醛及其聚合物的性质

甲醛是最常用的固定剂，通常使用的是10%福尔马林或4%多聚甲醛溶液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当、允许标本长期保存的特点，适用于绝大多数组织样本的固定。

甲醛是小分子气体（HCHO），可在水中迅速溶解，与水分子结合形成亚甲基水合物，HO-CH₂-OH。水合物亚甲基分子相互反应，结合形成聚合物（图1）。福尔马林中大多数甲醛以低聚合物形式存在（图1公式中n = 2~8)；多聚甲醛为n高达100的高聚合物。微碱性溶液中的氢氧根离子可以催化聚合物的水解。

图1. 甲醛聚合物分子结构

甲醛与蛋白质的反应

甲醛的固定作用源于它与蛋白质的反应。甲醛可以与蛋白质的氨基和其他基团结合，当甲醛与2个分子结合使其靠得很近，就会交联形成“-CH₂-”，称为亚甲基桥（图2A,B）。甲醛最易在赖氨酸侧链末端的氮原子和肽链的氮原子之间形成交联（图2C），并且这种交联的数量随着时间的推移而增加。碳水化合物、脂类和核酸等物质被困在蛋白质交联成的网状结构中。

图2. 甲醛与蛋白质的固定反应

细胞固定的重要意义

• 1、将蛋白质交联成网，稳定细胞（核）的结构细节；

• 2、将RNA分子固定在蛋白质交联网状结构中，以便后续进行细胞（核）内的原位逆转录反应；

• 3、液滴包裹后，为oligo序列与逆转录产物cDNA结合提供反应场所，完成细胞标记。

  图3. M20 Seq细胞（核）内原位逆转录及细胞标记过程

关于M20 Genomics

M20 Genomics（简称“M20”）成立于2021年2月，是一家专注于单细胞技术开发及应用的生命科技公司，总部位于中国杭州。

M20主创成员来自国内外顶尖高校，长期从事单细胞测序及相关技术的研究和应用，在各自领域内拥有全球领先的科研和转化成果。公司自主研发的全球首个基于随机引物的全样本高通量单细胞测序产品 – VITA系列，突破性地实现了全样本类型、全物种和全长RNA的（超）高通量单细胞转录组测序。

M20立志打破壁垒，找到前行的力量，探索生命的本源，以新一代单细胞技术引领生命科技的发展。

 敬请关注

    获取更多资讯！

E

N

D